Агар кристенсена с мочевиной инструкция по применению

• В 1875 году Реох предположил, что за щелочную реакцию ответственны микроорганизмы. брожение мочи (мочевины) и последующим образованием аммиака.
• Впоследствии были выделены многочисленные типы бактерий, разлагающих мочевину, и исследована их уреазная активность. Уреазная активность является важным критерием для идентификации видов Proteus и позволяет отделить Proteus от представителей Enterobacteriaceae, не ферментирующих лактозу.
• Стюарт разработал среду с определенным химическим составом, которая, как было показано, является дифференциальной для видов Proteus.
• В этой среде Proteus могут использовать мочевину в качестве единственного источника азота и создавать достаточное количество аммиака, чтобы преодолеть высокую буферную способность среды, что приводит к изменению цвета от желтого до ярко-розового (фуксия).
• Позже Кристенсен разработал среду, которая поддерживала бы рост представителей семейства Enterobacteriaceae, которые не могут использовать аммиак в качестве основного источника азота.
• Эта среда также имеет пониженную буферную способность, что позволяет обнаруживать меньшее количество щелочи, образующейся при распаде мочевины.
• Следовательно, на агаре с мочевиной Кристенсена можно обнаружить микроорганизмы со слабой или замедленной уреазной активностью.

Что такое уреазный тест?

• Целью уреазного теста является выявление микроорганизмов, способных гидролизовать мочевину с помощью фермент уреаза.
• Реох предложил в 1875 году оценить щелочные брожение мочевины и образования аммиака бактериями для определения способности организма вырабатывать уреазу. Подщелачивание вызывает пурпурно-красный оттенок в присутствии фенолового красного.
• Его часто используют для дифференциации род Протей от других кишечных бактерий. Аммиак образуется как один из побочных продуктов гидролиза мочевины.
• Это слабое основание повышает рН среды выше 8.4, в результате чего феноловый красный, индикатор рН, меняет цвет с желтого на розовый.
• Proteus mirabilis является эффективным гидролизатором мочевины (здесь изображена центральная трубка).
• Крайняя правая пробирка была заражена организм отсутствует уреаза, тогда как крайняя левая трубка не была инфицирована.
• Уреаза представляет собой фермент, вырабатываемый бактериями зубного налета для поддержания pH зубной биопленки путем гидролиза мочевины из слюны и десневого экссудата в аммиак.
• Цель этой работы состояла в том, чтобы оценить уреазную активность видов бактерий полости рта с использованием быстрого уреазного теста (RUT) в формате микропланшета и выяснить, можно ли использовать этот тест для измерения уреазной активности в наддесневых образцах зубного налета ex vivo. .

Цель уреазного теста

• Уреазный тест позволяет обнаружить микроорганизмы, способные гидролизовать мочевину до аммиака и углекислого газа.
• Дифференцировать Proteeae с уреазой от других Enterobacteriaceae.
• Его можно использовать для выявления инфекции Helicobacter pylori.

Принцип уреазного теста

• Уреаза представляет собой эндогенно вырабатываемый фермент, расщепляющий мочевину на углекислый газ и аммиак.
• Среда для уреазного теста содержит 2% мочевины и индикатор pH феноловый красный.
• Из-за образования аммиака увеличение pH вызывает изменение цвета с желтого (pH 6.8) на ярко-розовый (pH 8.2).
• Бульон Стюарта с мочевиной представляет собой сильно забуференную среду, которая требует значительных доз аммиака для повышения pH выше 8.0, вызывая изменение оттенка.
• Эта среда содержит все необходимые питательные вещества для Proteus, что делает ее уникальной.
• Агар с мочевиной Кристенсена содержит пептоны и глюкозу и имеет более низкое содержание буфера.
• Эта среда обеспечивает рост многих энтеробактерий, позволяя наблюдать активность уреазы.

(NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3

Среда, используемая для уреазного теста

Для обнаружения активности уреазы обычно используют два типа сред. Агар с мочевиной Кристенсена используется для определения активности уреазы у многих бактерий. Бульон с мочевиной Стюарта в основном используется для различения видов Proteus. Обе формы сред коммерчески доступны в виде тюбиков или порошка.

Агар с мочевиной Кристенсена 

Состав мочевинного агара Кристенсена 

Приготовление мочевинного агара Кристенсена 

1. Растворите первые шесть ингредиентов в 100 мл дистиллированной воды и простерилизуйте фильтрованием, чтобы приготовить мочевинную основу (размер пор 0.45 мм).
2. Агар суспендируют в 900 мл дистиллированной воды, нагревают до полного растворения и автоклав в течение 15 минут при температуре 121°C и давлении 15 фунтов на квадратный дюйм.
3. Охладите агар до 50-55 градусов Цельсия.
4. Асептически соедините 100 мл стерилизованной фильтрацией основы мочевины с охлажденным раствором агара.
5. Распределите по 4–5 мл в каждую стерильную пробирку (13 х 100 мм) и наклоните пробирки, пока они не затвердеют во время охлаждения.
6. Длинный скос и короткая задница — отличные качества.
7. Готовая среда будет желто-оранжевого оттенка.
8. Охладите подготовленную среду при температуре от 4 до 8 градусов Цельсия до использования.
9. Не нагревайте среду после ее приготовления, иначе мочевина распадется.

Бульон Стюарта с мочевиной 

Состав мочевинного бульона Стюарта 

Приготовление мочевинного бульона Стюарта 

1. Растворите все ингредиенты в 1 л дистиллированной воды, затем профильтруйте раствор (размер пор 0.45 мм).
2. Распределить 3 мл приготовленного бульона на стерильную пробирку (13 х 100 мм) (13 х 100 мм).
3. Готовая среда будет желто-оранжевого оттенка.
4. Охладите приготовленный бульон при температуре от 4 до 8 градусов Цельсия до использования.
5. Не нагревайте среду, так как при нагревании мочевина разлагается.

Методика уреазного теста

Уреазный тест с использованием мочевинного агара Кристенсена – Solid Media

• Нанесите сильный инокулят, полученный из 18-24-часовой чистой культуры, на всю скошенную поверхность.
• Не протыкайте приклад, так как он будет использоваться для контроля цвета.
• Инкубируйте пробирки с незакрепленными крышками при 35°C.
• Наблюдайте за изменением оттенка каждые шесть часов, двадцать четыре часа и каждый день в течение шести дней.

Уреазный тест с использованием мочевинного бульона Стюарта – жидкая среда

1. Используйте плотный инокулят из чистой культуры, которая собиралась от 18 до 24 часов, чтобы начать приготовление бульона.
2. Аккуратно встряхните пробирку, чтобы переместить бактерии.
3. При температуре 35oC поместите пробирки с незакрепленными крышками в инкубатор.
4. Через 8, 12, 24 и 48 часов наблюдайте за изменением цвета бульона. 

Результат уреазного теста

Агар с мочевиной Кристенсена

• Положительный тест: Ярко-розовый (фуксия) цвет на скосе, который может переходить в комель, показывает, что производится мочевина. Имейте в виду, что любое количество розового цвета — хороший знак.
• Отрицательный тест: Если в организме нет уреазы, культуральная среда останется желтой.

Внимание

• Если тест не проводится слишком долго, белки в среде может разрушаться и давать ложноположительный результат.
• Для исключения следует использовать контрольную среду без мочевины. белок гидролиз как причина положительного теста.
• Быстро уреазоположительные Proteeae (Proteus spp., Morganella morganii и некоторые штаммы Providencia stuartii) вызывают сильную положительную реакцию в течение 1–6 часов после инкубации.
• Отсроченно-положительные микроорганизмы, такие как Klebsiella или Enterobacter, обычно проявляют слабую положительную реакцию на скосе через 6 часов, но реакция становится более сильной и распространяется на приклад с течением времени (до 6 дней).

Бульон Стюарта с мочевиной 

• Положительный тест: О наличии мочевины свидетельствует ярко-розовый (фуксия) цвет бульона.
• Отрицательный тест: Цвет не меняется на розовый.

Примечание:

• Быстро уреазоположительные Proteeae (Proteus spp., Morganella morganii и некоторые штаммы Providencia stuarti), для которых эта среда отличается, будут давать сильную положительную реакцию уже через 8 часов, но всегда в течение 48 часов после инкубации.
• Из-за высокой буферной способности этой среды микроорганизмы, проявляющие отсроченную реакцию, такие как Enterobacter, не будут давать положительной реакции.

Уреаза положительный и отрицательный тест Организмы

Комментарии и советы

• Наборы для экспресс-анализа мочи можно купить в магазинах.
• Добавляя петлю культуры к 0.5 мл бульона Стюарта с мочевиной, вы также можете получить хорошие результаты.
• На скошенном агаре с мочевиной Proteus spp. может быстро расти (примерно за 1 или 2 часа), если в одно место на полпути вверх по скосу нанести обильный инокулят.
• Helicobacter pylori также положительна по уреазе, и это клинически важные бактерии.
• В клинической лаборатории существует множество различных тестов и сред, которые можно использовать для обнаружения H. pylori.

Случай хеликобактер пилори

Helicobacter pylori расщепляет мочевину быстро, обычно за 30 секунд. Одна вещь, которая отличает H. pylori от других видов Helicobacter, заключается в том, насколько быстро она движется. В клинической лаборатории было сделано множество различных тестов и сред для обнаружения H. pylori.

1. Экспресс-тест на уреазу

• Экспресс-тест на уреазу, который также называют тестом на кампилобактер-подобные организмы (CLO), — это быстрый способ узнать, есть ли у вас Helicobacter pylori.
• Тест основан на том, насколько хорошо H. pylori может высвобождать фермент уреазу. Образец, такой как биопсия желудка, помещается в гель, содержащий мочевину.
• Уреаза H. pylori быстро расщепляет мочевину на аммиак и воду, что меняет цвет индикатора.

Итоги

• Результаты можно прочитать от 1 минуты до 3 часов, но в некоторых случаях тест CLO может быть отложен на срок до 24 часов.

2. Дыхательный тест с мочевиной

• Большинство людей думают, что дыхательный тест с мочевиной — это простой, неинвазивный и точный способ показать, что у вас есть Helicobacter pylori.
• Идея теста проста для понимания. Помеченная изотопами мочевина, принимаемая внутрь, либо с 14С, либо с 13С (лучше 13С), расщепляется ферментом уреазой H. pylori, и меченый СО2 выдыхается.
• Либо сцинтилляционный счетчик (углерод-14), либо соотношение изотопов. масс-спектрометрии или масс-корреляционная спектрометрия может найти меченый CO2 (углерод-13).
• С чувствительностью и специфичностью от 95 до 100%, UBT в основном используется для подтверждения того, что эрадикация прошла успешно. Чтобы тестирование было точным, его следует проводить через 4–6 недель после окончания лечения и через 5 дней после приема антацидов.
• Тест также является отличным способом проверить наличие инфекции, когда язва обнаружена во время эндоскопии, но биопсия не может быть сделана, потому что пациент принимает антикоагулянты.

Пользы

• Он используется, чтобы выяснить, есть ли в образце биопсии ткани H. pylori.
• Он используется, чтобы показать разницу между Candida Albicans и Cryptococcus neoformans. Первый из них уреазоотрицательный, второй уреазоположительный.
• С помощью этого теста можно обнаружить некоторые виды Enterobacteriaceae, такие как Klesiella и Proteus.
• Виды бруцелл и криптококков можно обнаружить с помощью уреазного теста.

Ограничения

• Такие микроорганизмы, как H. pylori и Brucella, быстро расщепляют мочевину, что может изменить результат теста.
• Для полной идентификации следует провести биохимический тест и/или серологический тест.
• Не используйте инокулят из суспензии бульона, чтобы ускорить рост и расщепление мочевины.
• При длительном хранении культуры в инкубаторе будет наблюдаться ложноположительная щелочная реакция.
• Мочевина чувствительна к теплу, поэтому не подвергайте скошенный агар с мочевиной прямому нагреванию. Когда мочевина подвергается воздействию тепла, она разрушается.
• Если вы тестируете виды Proteus, обязательно проверьте прививку в течение шести часов, чтобы узнать, не произошло ли что-нибудь.
• Убедитесь, что крышка открыта, когда вы инкубируете среду. Если вы этого не сделаете, это может изменить результат.
• Храните пробирку в темном месте, потому что мочевина разрушается сама по себе при воздействии света.
• Агар с мочевиной не должен быть единственным способом выяснить, сколько уреазы работает, потому что разные организмы имеют разные способности и скорость гидролиза.

Контроль качества

• Положительный контроль (ПК): Proteus mirabilis (уреазоположительные бактерии)
• Отрицательный контроль (NC): Escherichia coli (уреазоотрицательные бактерии)
• Незасеянный (ООН): Наряду с тестовой средой культивируют незасеянную среду для сравнения изменения цвета.

Рекомендации

• https://asm.org/getattachment/ac4fe214-106d-407c-b6c6-e3bb49ac6ffb/urease-test-protocol-3223.pdf
• https://microbiologie-clinique.com/urease-test-principle-protocol-results.html
• https://microbenotes.com/urease-test-principle-procedure-and-result/
• https://microbeonline.com/urease-test-principle-procedure-interpretation-and-urease-positive-organsims/
• http://www.uwyo.edu/molb2021/additional_info/summ_biochem/urease.html
• https://bmcoralhealth.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12903-018-0541-3
• https://www.austincc.edu/microbugz/urease_test.php
• https://bmcgastroenterol.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-230X-5-38
• https://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=76&sim=214&cnt=1
• https://himedialabs.com/TD/M1828.pdf
• https://www.labtestsguide.com/urease-test
• https://universe84a.com/urease-test/

Мы надеемся, что вам понравилось читать нашу последнюю статью в блоге! Мы очень рады видеть положительный отклик, который он получает до сих пор. Мы понимаем, что иногда после просмотра интересного контента у вас могут возникнуть вопросы или вы захотите углубиться в тему.

Для облегчения содержательных дискуссий и поощрения обмена знаниями мы создали специальную страницу форума QNA, связанную с этой конкретной статьей. Если у вас есть какие-либо вопросы, комментарии или мысли, которыми вы хотели бы поделиться, мы приглашаем вас посетить форум QNA.

Страница форума QNA

Не стесняйтесь задавать свои вопросы или участвовать в текущих дискуссиях. Наша команда экспертов, а также другие читатели будут активно участвовать в форуме, чтобы взаимодействовать с вами и давать проницательные ответы. Помните, что обмен своими мыслями не только помогает вам глубже понять, но также способствует росту и обучению сообщества. Мы надеемся услышать от вас и способствовать обогащающей дискуссии. Спасибо за участие в нашем путешествии!