Инструкция по работе с биохимической тест системой

Определение родовой, видовой и таловой принадлежности микроорганизмов на основании изучения морфологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных и антигенных свойств — наиболее ответственная часть микробиологического исследования.

Большое количество патогенов, принимающих участие в возникновении инфекционного процесса, обусловливает применение различных тестов по определению ферментативных свойств путем постановки большого количества биохимических реакций, что позволяет в комплексе с другими данными определить вид микроорганизма. Этот наиболее трудоемкий процесс выполняется в несколько этапов, требует большого количества дифференциально-диагностических сред, реактивов, посуды, что значительно удорожает стоимость анализа и удлиняет сроки его проведения. Результаты удается получить через 4…7 сут. Поэтому для идентификации микроорганизмов наиболее перспективны микрообъемные коммерческие тест-системы (МТС). Они избавляют практических бактериологов от трудоемких и дорогостоящих процедур и позволяют получать стандартные, сопоставимые, воспроизводимые данные, экономят реактивы, ускоряют выдачу результата анализа.

Коммерческие тест-системы для биохимической идентификации микроорганизмов различных групп представляют собой готовые к использованию полистироловые планшеты и панели с сухими дифференцирующими средами или субстратами, которые выпускаются разными производителями.

Коммерческие тест-системы на основе полистироловых планшетов. В Российской Федерации наибольшее распространение получили следующие тест-системы.

1. Микротест-системы (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала) для идентификации микробов. Они представляют собой контейнер из прозрачного полистирола, состоящий из 12 одинаковых ячеек, которые содержат сухие питательные среды с различными углеводами, многоатомными спиртами, аминокислотами, солями неорганических кислот и индикатором pH, стабилизированные поливиниловым спиртом. Перечень выпускаемых МТС для идентификации микроорганизмов, имеющих ветеринарное назначение, включает в себя МТС-М-12Е (биохимическая идентификация энтеробактерий), МТС-5У (определение ферментативной активности энтеробактерий), МТС-С (биохимическая идентификация стафилококков), МТС-Стреп (биохимическая идентификация стрептококков), МТС-Л (биохимическая идентификация листерий), МТС-Сальм (биохимическая идентификация сальмонелл).

2. МТС («Плива-Лахема», Чехия) для биохимической идентификации энтеробактерий (ЭНТЕРО-тест 16; ЭНТЕРО-тест 24; ЭНТЕРО-скрин; ЭНТЕРО-Рапид 24), для энтерококков (ЭН-коккус-тест), стафилококков (СТАФИ-тест 16), стрептококков (СТРЕПТО-тест 16), анаэробов, выделенных из пищевых продуктов и кишечника (АНАЭРО-тест 23), бактериальной бета-лактамазной активности (бета-ЛАКТАМ-тест).

3. Одноразовые диагностические пластины (НПО «Диагностические системы», НИИЭМ, г. Нижний Новгород) ПБДБ (для идентификации энтеробактерий) и ПБДС (для идентификации стафилококков).

4. Системы на основе стандартных 96-луночных микротитровальных планшетов для идентификации энтеробактерий (ММТ-Е1 и ММТ-Е2) (Ставропольская государственная медицинская академия).

5. Наборы для ускоренной (в течение 5 ч) идентификации энтеробактерий РапидЭнтеро 200 и РапидЭнтеро 750 (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург).

Помимо вышеперечисленных используют и зарубежные диагностические системы для идентификации различных микроорганизмов в течение 3…48 ч: API, ID (Bio Merieux, Франция), BBL Crystal (Becton Dikinson), «MicroScan» (Dade, США), MicroTax (Sy-Lab, Австрия).

Диагностические полоски и диски для биохимической идентификации микроорганизмов. Системы индикаторные бумажные (СИБ) представляют собой полоски или диски из хроматографической бумаги, пропитанные соответствующим субстратом и индикатором и покрытые для стабилизации водным раствором поливинилового спирта.

Реакцию ставят, как правило, пробирочным методом. В пробирку помещают 0,3 мл физиологического раствора или мясопептонного бульона, затем туда вносят петлей колонию изучаемого микроба и соответствующий диск. Учет реакции через 4…5 ч по изменению цвета бумажного диска. Срок годности СИБ составляет 1 год. СИБ для идентификации энтеробактерий производит НПО «Диагностические системы» (НИИЭМ, г. Нижний Новгород), коммерческие наборы СИБ для ускоренного определения колититра воды — ФГУП НПО «Питательные среды» (г. Махачкала). СИБ по сравнению с МТС гораздо дешевле, зато работа с ними требует больше труда и времени.

Могут быть использованы как дополнительные к планшетным, так и самостоятельно в качестве идентификационных диагностические полоски («Плива-Лахема» производит семь типов). Диагностические полоски представляют собой пластмассовые полоски, на одном конце которых наклеена полоска индикации из фильтровальной бумаги, содержащей субстрат для выявления бактериального фермента или метаболита. В зависимости от типа полосок бактериальную культуру или наносят непосредственно на зону индикации полоски, или ее опускают в пробирку с исследуемой бактериальной суспензией и выращивают в течение определенного времени. Перечень выпускаемых диагностических полосок включает в себя: 1) ОКСИ-тест (для выявления бактериальной цитохромоксидазы); 2) ОНР-тест (для обнаружения β-галактозидазы); 3) ГИППУРАТ-тест (для обнаружения способности бактерий гидролизовать гиппурат натрия, а также для предварительной идентификации стрептококков группы B и Campylobacter jejuni); 4) ПИРА-тест (для быстрого выявления активности фермента пирролидонилариламидазы), а также для дифференциации энтерококков (тест положительный) от стрептококков (за исключением S. pyogenes); 5) ВП-тест (для постановки реакции Фогэс—Проскауэра за 2…4 ч).

Помимо диагностических полосок можно использовать также диагностические диски («Плива-Лахема»), позволяющие проводить простую селективную изоляцию и дифференциацию бактерий прямо на питательной среде. Диски из фильтровальной бумаги содержат определенные концентрации высушенных реагентов для выявления специфической бактериальной активности.

1. Диски с бацитрацином (10 ЕД). Применяют для селективной изоляции Haemophilus spp. при первичном культивировании. Тест основан на устойчивости Haemophilus spp. к высоким концентрациям бацитрацина по сравнению с сопутствующей флорой и саттелитного роста микроорганизмов этого рода в зоне диффузии экзогенных факторов роста из культуры S. aureus.

2. Диски с бацитрацином S. Предназначены для предварительной индикации β-гемолитических стрептококков группы А (S. pyogenes). Тест основан на высокой чувствительности S. pyogenes к незначительным концентрациям бацитрацина (0,04 ЕД), обеспечивающей образование зон задержки роста вокруг диска. Другие β-гемолитические стрептококки резистентны к таким дозам или образуют незначительные зоны ингибиции роста.

3. Диски с оптохином. Предназначены для рутинной первичной индикации S. pneumoniae и дифференциации их от других зеленящих стрептококков. Принцип теста основан на избирательной чувствительности пневмококков к оптохину и резистентности к нему других зеленящих стрептококков.

Общие правила работы с МТС. Методика проведения микробиологических исследований с использованием МТС должна полностью соответствовать прилагаемой инструкции. Общая схема работы с тест-системами состоит из следующих этапов.

1. Выделение культуры. Для работы с МТС используют только чистые культуры. При их выделении особое внимание следует уделять качеству питательных сред. От этого зависит видовой состав изолированных микроорганизмов, их количество в исследуемом материале и успех идентификации. По результатам первичного посева и микроскопии проводят дифференциацию культур на грамположительные и грамотрицательные кокки и палочки.

2. Приготовление бактериальной суспензии. Суспензию готовят в рекомендованной суспензионной среде из чистой 18…24-часовой культуры определенной степени мутности согласно инструкции. Использование слишком густой или жидкой суспензии может привести к ложным результатам. Параллельно делают контрольный высев взвеси культуры на кровяной агар для проверки ее чистоты, ростовых свойств и (или) для постановки дополнительных тестов.

3. Инокуляция. Суспензию тщательно встряхивают; необходимый объем вносят в каждую лунку соответствующего ряда. После этого в определенные лунки для создания анаэробных условий добавляют по 2 капли стерильного вазелинового или парафинового масла.

4. Инкубация. Планшеты в полиэтиленовых пакетах или закрытые крышками инкубируют при 30…37 °С в течение 4…48 ч.

5. Оценка результатов. По окончании выращивания проверяют чистоту культуры по контрольному посеву. При отсутствии роста увеличивают время инкубации. Затем добавляют в определенные лунки необходимые реактивы, позволяющие визуализировать или усилить цветные реакции. Учет проводят визуально с помощью специальных таблиц, цветовых шкал и (или) цветных реакций контрольных штаммов и заносят их в бланки.

6. Идентификация. Проводят с помощью таблиц биохимической активности, индексов профилей, книг-кодов или компьютерных программ.

При окончательной идентификации учитывают дополнительную информацию (микроскопия, характер колоний, наличие гемолиза, пигментообразование, подвижность и т. д.).

При работе с тест-системами следует придерживаться следующих рекомендаций.

1. Строго соблюдать правила работы с инфицированным материалом.

2. После употребления МТС необходимо обезвреживать автоклавированием при (120+2) °С в течение 1 ч.

3. Строго соблюдать условия и сроки хранения в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к тест-системам.

4. Если культуру не удается идентифицировать, следует проверить ее чистоту и повторить исследование.

5. При отсутствии роста на контрольной чашке необходимо увеличить время инкубации.

Содержание

• Классификация
• Универсальный
• пример
• Дифференциалы
• пример
• Конкретный
• пример
• Виды биохимических тестов
• Каталазный тест
• Оксидазный тест
• Тест с соленым маннитоловым агаром (MSA)
• Коагулазный тест
• Тест на уреазу
• Для чего нужны биохимические тесты?
• Важность
• Ссылки

В Биохимические тесты в микробиологии они представляют собой набор химических тестов, которые проводятся на микроорганизмах, присутствующих в образце, с целью их идентификации; эти микроорганизмы обычно являются бактериями. Микробиологу доступно большое количество биохимических тестов.

Однако выбор этих тестов основан на предварительных результатах, таких как образец окраски по Граму и признаки роста, которые позволяют отнести бактерии к определенной категории. Биохимические тесты в основном основаны на метаболических свойствах каждого типа бактерий.

Не все бактерии обладают одинаковыми свойствами, поэтому исследуют, есть ли у них какой-либо конкретный фермент, добавляя субстрат и ожидая реакции. Обычно это определение дается по изменению цвета или pH культуральной среды.

Для надежной идентификации бактерии на уровне вида часто требуется менее 15 биохимических тестов. Проведение большего количества биохимических тестов может повысить уверенность в идентификации.

Большинство этих биохимических тестов проводится на сыворотке или плазме крови. Однако они также могут выполняться с другими биологическими выделениями, такими как моча, спинномозговая жидкость, плевральная жидкость и фекалии, среди прочего.

Классификация

Биохимические тесты можно разделить на 3 группы:

Универсальный

Это тесты, которые можно выполнить на любом образце и которые направляют микробиолога на следующие биохимические тесты, которые необходимо выполнить для получения надежной идентификации.

пример

Каталазно-оксидазный тест.

Дифференциалы

Это тесты, проводимые для выявления микроорганизмов, присутствующих в образце, вплоть до видового уровня.

Идентификация производится по результатам комбинации тестов, поскольку отдельные результаты недостаточно информативны для идентификации.

пример

Тесты IMViC и тесты на утилизацию сахара.

Конкретный

Это специальные тесты для определенного набора видов или для подтипа видов. Эти тесты обычно проводятся для подтверждения или идентификации на уровне подвидов. Отдельные тесты информативны сами по себе.

пример

Тест на γ-глутамиламинопептидазу.

Виды биохимических тестов

Каталазный тест

Тест на каталазу — это тест, демонстрирующий присутствие фермента каталазы путем разложения перекиси водорода на кислород и воду. К капле перекиси водорода (3%) на предметном стекле добавляется небольшое количество бактерий.

Тест на каталазу — это простой тест, используемый микробиологами для определения видов бактерий и определения способности некоторых микробов расщеплять перекись водорода путем выработки фермента каталазы.

Если наблюдаются пузырьки кислорода, это означает, что у бактерий есть фермент каталаза, потому что он катализирует разложение перекиси водорода на кислород и воду. В таком случае говорят, что организм является каталазоположительным (например: Золотистый стафилококк).

Оксидазный тест

Этот тест используется для идентификации микроорганизмов, содержащих фермент цитохромоксидазу (важный в цепи переноса электронов). Он обычно используется для различения семейств Enterobacteriaceae и Pseudomadaceae.

Цитохромоксидаза переносит электроны из цепи переноса электронов на кислород (конечный акцептор электронов) и восстанавливает его до воды. В оксидазном тесте используются искусственные молекулы донора и акцептора электронов.

Когда донор электронов окисляется под действием цитохромоксидазы, среда становится темно-фиолетовой и считается положительным результатом. Микроорганизм Синегнойная палочка это пример бактерии с положительной оксидазой.

Тест с соленым маннитоловым агаром (MSA)

Этот тип теста бывает как выборочным, так и дифференциальным. MSA выберет организмы, способные жить в среде с высокой концентрацией соли, например, виды Стафилококк в отличие от видов Стрептококк, рост которых в этих условиях тормозится.

Дифференциальный компонент в этом тесте — сахар маннит. Организмы, способные использовать маннит в качестве источника пищи, будут производить побочные продукты ферментации, которые являются кислыми и, таким образом, понижают pH среды.

Из-за кислотности среды индикатор pH, феноловый красный, становится желтым. Примеры видов бактерий, которые можно дифференцировать с помощью этого метода: Золотистый стафилококк (положительно, потому что маннитол ферментирует) и Эпидермальный стафилококк (отрицательно, потому что маннит не ферментирует).

Коагулазный тест

Коагулаза — это фермент, который способствует свертыванию плазмы крови. Этот тест проводится на грамположительных и каталазоположительных бактериях для идентификации Золотистый стафилококк (коагулаза положительная). Фактически, коагулаза является фактором вирулентности этого вида бактерий.

Образование сгустка вокруг инфекции, вызванной этой бактерией, вероятно, защищает ее от фагоцитоза. Этот тест очень полезен, когда вы хотите различать Золотистый стафилококк других видов Стафилококк коагулазо-отрицательные.

Тест на уреазу

Этот тест используется для выявления бактерий, способных гидролизовать мочевину с помощью фермента уреазы. Обычно используется для различения пола Протей от других кишечных бактерий.

При гидролизе мочевины одним из продуктов является аммиак. Это слабое основание увеличивает pH среды выше 8,4, и индикатор pH (феноловый красный) изменяется с желтого на розовый. Примером уреазоположительных бактерий является Протей мирабилис.

Для чего нужны биохимические тесты?

Биохимические тесты в микробиологии используются для диагностики заболеваний, вызванных микробами, и для мониторинга лечения, применяемого для борьбы с ними. Кроме того, они используются для выявления инфекционных заболеваний и их прогноза.

Биохимическая идентификация микроорганизмов дает представление о том, что эти микроорганизмы способны делать, будучи возможной дискриминацией различных штаммов одного и того же вида по определенным биохимическим профилям.

Различия в активности конкретных ферментов определяют экологию, физиологию или естественную среду обитания микроорганизмов, что в некоторых случаях может считаться важной информацией.

Важность

Структурные различия в форме, размере и расположении бактерий мало помогают в процессе идентификации, потому что существует множество видов бактерий, похожих по форме, размеру и расположению.

По этой причине идентификация бактерий в конечном итоге основана в первую очередь на различиях в их биохимической активности.

У каждого вида бактерий есть четко определенный набор метаболической активности, отличный от всех других видов. Эти биохимические «отпечатки пальцев» — это свойства, контролируемые бактериальными ферментами.

Таким образом, биохимические тесты важны, потому что они помогают исследователю правильно идентифицировать патогены, присутствующие в образце, и, таким образом, иметь возможность рекомендовать соответствующее лечение пациенту.

Ссылки

1. Беккет, Г., Уокер, С., Рэй, П. (2010). Клиническая биохимия (8-е изд.). Вили-Блэквелл.
2. Кларк П. Х. и Коуэн С. Т. (1952). Биохимические методы бактериологии. Журнал общей микробиологии, 6(1952), 187–197.
3. Гоу, А., Мерфи, М., Шривастава, Р., Коуэн, Р., Сент, Д. и О’Рейли, Дж. (2013). Клиническая биохимия (5-е изд.). Elsevier Health Sciences.
4. Гольдман, Э. и Грин, Л. (2008). Практическое руководство по микробиологии (2-е изд.). CRC Press.
5. Харриган, В. (1998). Лабораторные методы пищевой микробиологии (3-е изд.). Академическая пресса.
6. Васантакумари, Р. (2009). Практическая микробиология. BI Publications Pvt Ltd.

ГОСТ Р 8.891-2015

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Государственная система обеспечения единства измерений

ИЗМЕРИТЕЛЬНЫЕ И ИНДИКАТОРНЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

Технические и метрологические требования. Основные положения

State system for ensuring the uniformity of measurements. Measuring and indicating biochemistry test systems. Technical and metrological requirements. Basic principles

ОКС 11.100

          17.020

Дата введения 2016-07-01

 Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным унитарным предприятием «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы» (ФГУП «ВНИИМС»)

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 53 «Основные нормы и правила по обеспечению единства измерений»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ

Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 31 августа 2015 г. N 1208-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Март 2019 г.

Правила применения настоящего стандарта установлены в

статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. N 162-ФЗ «О стандартизации в Российской Федерации» . Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

 Введение

Настоящий стандарт разработан с целью формулирования единых требований к измерительным и индикаторным биохимическим тест-системам, несоблюдение которых может привести к искажениям результатов измерений.

«Измерительные биохимические тест-системы», рассматриваемые в настоящем стандарте, являются средствами измерений. Термин «измерительные биохимические тест-системы», вводимый настоящим стандартом, отличается от термина «тест-системы», используемого в области лабораторной диагностики. Термин «тест-системы» означает наборы реагентов для иммуноферментных, иммунохимических по

ГОСТ Р 51088-2013  «Медицинские изделия для диагностики ин витро. Реагенты, наборы реагентов, тест-системы, контрольные материалы, питательные среды. Требования к изделиям и поддерживающей документации», иммунохроматографических анализов. «Тест-системами» также называют тест-полоски, индикаторные диски и другие индикаторы. Такие «тест-системы» средствами измерений не являются.

Настоящий стандарт разработан для применения производителями и пользователями измерительных и индикаторных биохимических тест-систем. Измерительные биохимические тест-системы применяются пользователями, имеющими специальное образование и имеющими опыт работы с такими средствами измерений, для определения содержания компонентов в указанных диапазонах с установленными границами допускаемой погрешности.

Индикаторные биохимические тест-системы могут применяться пользователями, не имеющими опыта их применения и специального образования.

      1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает технические и метрологические требования к биохимическим тест-системам, применяемым при биохимическом анализе содержания компонентов в растворах или в биологических жидкостях и тканях, и предназначен для применения разработчиками и пользователями измерительных и индикаторных тест-систем.

Стандарт распространяется:

— на измерительные биохимические тест-системы;

— на индикаторные биохимические тест-системы.

Настоящий стандарт не содержит требований к полуколичественным тест-системам, реактивам и реагентам.

      2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 2.601  Единая система конструкторской документации. Эксплуатационные документы

ГОСТ 8.010  Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений. Основные положения

ГОСТ 12.1.005  Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ Р 8.563  Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений

ГОСТ Р 8.654  Государственная система обеспечения единства измерений. Требования к программному обеспечению средств измерений. Основные положения

ГОСТ Р 51088  Медицинские изделия для диагностики ин витро. Реагенты, наборы реагентов, тест-системы, контрольные материалы, питательные среды. Требования к изделиям и поддерживающей документации

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с указанным всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

      3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1

3.2

3.3 биологический материал: Биологические жидкости организма — слюна, моча, пот и ткани — кровь (плазма, сыворотка), включая их пробоподготовку или исключая ее.

3.4 биохимические методы анализа: Методы обнаружения и определения тех или иных веществ, в основе которых лежат биохимические процессы, т.е. трансформация одних соединений в другие или образование межмолекулярных комплексов с участием специфических биологических молекул — ферментов, антител, рецепторов и др.

Примечание — К биохимическим методам анализа также относятся иммунохимические методы, включая иммуноферментный, иммунохроматографический, иммунофлуоресцентный и др. методы анализа.

3.5

Примечание — К величинам, например, относятся: концентрация (аналита), объем (пробы), площадь (поверхности), масса (образца) и т.д.

3.6 влияющая величина: Физическая величина, которая не является объектом измерений, но которая оказывает влияние на значение измеряемой величины.

3.7 время срабатывания: Промежуток времени от начала использования тест-системы до получения различимого на фоне шумов сигнала.

3.8 измерительные биохимические тест-системы (измерительные тест-системы): Набор из одного или более средств измерений, представляющих собой устройства детекции и обработки измерительного сигнала (ридеров), одного или нескольких индикаторов и аттестованной методики измерений. Измерительные биохимические тест-системы позволяют количественно определить содержание (концентрацию) компонента в растворе или в биологической жидкости (например, методом калибровочных кривых).

Примечания

1 Определение термина «измерительные биохимические тест-системы» сформулировано с учетом определения «измерительной системы», приведенного в международном словаре VIM3 [1]*.

2 Введенный термин «измерительные биохимические тест-системы» отличается от термина «тест-системы», используемого в области лабораторной диагностики. Термин «тест-системы» означает наборы реагентов для иммуноферментных, иммунохимических по

ГОСТ Р 51088 , иммунохроматографических анализов. «Тест-системами» также называют тест-полоски, индикаторные диски и другие индикаторы. Такие «тест-системы» средствами измерений не являются.

3.9 индикатор: Техническое средство или вещество, предназначенное для установления наличия какой-либо физической величины или превышения уровня ее порогового значения.

Примечание — Определение «индикатор» относится к тест-полоскам, индикаторным дискам, сухим таблетированым формам и т.п.

3.10 индикаторные биохимические тест-системы (индикаторные тест-системы): Системы, предназначенные для определения присутствия или отсутствия компонента в растворе или в биологической жидкости.

Примечания

1 К операторам, осуществляющим работу с индикаторными тест-системами, не предъявляются требования по квалификации.

2 Получение результатов анализа посредством индикаторных тест-систем не требует сложной пробоподготовки.

3.11 калибровочная (градуировочная) кривая: Аппроксимирующая зависимость между значениями величин на выходе и входе средства измерений (ридера), полученная на основе экспериментальных данных.

3.12

3.13

3.14

3.15

Примечание — Определение «порог чувствительности тест-системы» сформулировано с учетом его определения, приведенного в

[2] .

3.17 пороговое значение концентрации (пороговая концентрация): Значение концентрации компонента, ниже которой вещество считается отсутствующим в растворе или в биологической жидкости, а при превышении данной концентрации — присутствующим.

3.18 пробоподготовка: Совокупность действий над пробой (измельчение, гомогенизация, экстракция, гидролиз, осаждение и пр.) с целью превращения пробы в подходящую для последующего анализа форму (сухой остаток, раствор и пр.), состояние вещества (основание, солевая форма, гидролиз конъюгатов и пр.), а также для концентрирования/разбавления аналита и избавления от мешающих анализу компонентов.

3.19

Примечание — Определение соответствует определению, приведенному в международном словаре VIM3 [1], статья 2.41.

3.20 селективность метода анализа: Возможность метода определять или обнаруживать искомый компонент в присутствии других сопутствующих компонентов.

3.21

      4 Общие положения

4.1 Характеристики биохимических тест-систем должны соответствовать требованиям, установленным в документации на биохимические тест-системы.

4.2 Реакции, лежащие в основе принципа действия биохимических тест-систем, должны быть селективными по отношению к определяемым компонентам или их сумме в зависимости от поставленной задачи и быстропротекающими.

4.3 Для индикаторных биохимических тест-систем при использовании цветных реакций в качестве индикации (для визуальной оценки), границы раздела окрашенных зон должны быть четкими, иметь высокую контрастность по отношению к фону подложки (в присутствии определяемого вещества).

4.4 Проведение измерений с помощью биохимических тест-систем должно соответствовать требованиям безопасности, установленным соответствующими

правилами по охране труда  [3], и требованиям по охране окружающей среды, установленным в соответствующем

Федеральном законе  [4].

      5 Метрологические и технические требования к измерительным биохимическим тест-системам

Измерительные биохимические тест-системы являются средствами измерений. Метрологические требования к средствам измерений устанавливаются

Федеральным законом  [5].

      5.1 Метрологические требования к измерительным биохимическим тест-системам

5.1.1 В добровольном порядке изготовители и пользователи измерительных тест-систем могут предоставлять их на утверждение типа в соответствии с

Федеральным законом  [5] (

статья 12 ). На поверку/калибровку измерительные тест-системы предоставляются в добровольном порядке в соответствии с

Федеральным законом  [5] (

статьи 13  и

18 ).

5.1.2 Метрологическими характеристиками измерительных биохимических тест-систем являются:

— чувствительность;

— порог чувствительности;

— время срабатывания;

— пороговая концентрация;

— прослеживаемость;

— погрешность (неопределенность) измерений;

— диапазон измерений;

— калибровочная кривая или набор калибровочных кривых для каждого типа измерительных тест-систем и для каждого аналита.

5.1.2.1 Порог чувствительности не должен превышать пороговую концентрацию.

5.1.2.2 Фактическое время срабатывания измерительных тест-систем должно соответствовать времени срабатывания, указанному в сопроводительной документации к измерительным тест-системам.

5.1.2.3 Результаты измерений, полученные посредством измерительных биохимических тест-систем, должны быть прослеживаемы через цепь непрерывных калибровок к государственным или международным первичным эталонам единиц величин международной системы единиц (СИ).

В случае, если свойства биологического материала не могут быть выражены в единицах СИ, допускается прослеживать результаты измерений к внесистемным международным единицам. Тем не менее, на каждом этапе измерений должны быть получены значения, которые прослеживаются до соответствующей единицы СИ.

5.1.2.4 Значение погрешности (неопределенности) результатов измерений, получаемых с помощью измерительных тест-систем, должно соответствовать значению, указанному в сопроводительной документации к измерительным тест-системам.

5.1.2.5 Диапазон измерений измерительных тест-систем должен содержать пороговую концентрацию и быть достаточным для получения достоверного результата измерений.

5.1.2.6 Измерительные биохимические тест-системы должны иметь калибровочную кривую или набор калибровочных кривых для каждого типа измерительных тест-систем и для каждого определяемого посредством измерительных тест-систем компонента.

5.1.2.7 Основная погрешность измерений измерительных тест-систем должна находиться в установленных пределах при нормальных условиях. При воздействии влияющих величин нормируется дополнительная погрешность измерений.

      5.2 Технические требования к измерительным биохимическим тест-системам

К техническим требованиям к измерительным биохимическим тест-системам относятся:

— назначение, определяющее основные функции измерительных тест-систем;

— указание анализируемой величины;

— указание вида биологического материала, используемого для анализа;

— срок годности;

— габаритные размеры;

— требования к безопасности измерительных тест-систем;

— масса ридера;

— потребляемая мощность ридера;

— количество индикаторов;

— сведения об утилизации измерительной тест-системы и ее составных частей;

— условия применения, транспортирования и хранения.

      5.3 Требования к документации на измерительные биохимические тест-системы

5.3.1 Измерительные биохимические тест-системы должны сопровождаться соответствующей документацией, в том числе эксплуатационной по

ГОСТ 2.601 . Документация должна полно и однозначно описывать назначение, метрологические и технические характеристики измерительных тест-систем. При проверке документации в обязательном порядке должна происходить проверка соответствия сопроводительной документации требованиям 5.3.2-5.3.5.

5.3.2 Минимальный набор документов, сопровождающих измерительные тест-системы, должен содержать следующие документы:

— паспорт;

— инструкцию по применению;

— методики (методы) измерений, аттестованные в установленном порядке, если они не включены в инструкцию по применению;

________________

5.3.3 В паспорте отображают метрологические и технические требования, а также следующую информацию:

— наименование измерительных биохимических тест-систем;

— назначение;

— сведения об изготовителе;

— указание анализируемой величины;

— указание вида биологического материала, используемого для анализа;

— дату изготовления;

— номер серии, номер и дату выдачи паспорта;

— гарантии изготовителя;

— срок годности;

— габаритные размеры;

— требования к безопасности измерительных тест-систем;

— массу ридера;

— потребляемую мощность ридера;

— количество индикаторов;

— сведения о сертификации измерительной тест-системы и ее составных частей;

— сведения об утилизации измерительной тест-системы и ее составных частей;

— чувствительность;

— порог чувствительности;

— пороговую концентрацию;

— время срабатывания;

— прослеживаемость;

— погрешность (неопределенность) измерений;

— диапазон измерений;

— калибровочную кривую или набор калибровочных кривых для каждого типа измерительных биохимических тест-систем и для каждого определяемого посредством измерительных тест-систем компонента;

— сведения о поверке;

— условия применения, транспортирования и хранения.

5.3.4 Инструкция по применению должна содержать:

— назначение;

— метрологические и технические характеристики измерительной биохимической тест-системы;

— условия хранения;

— условия применения;

— меры предосторожности при работе с измерительными тест-системами;

— оборудование и материалы, необходимые при работе с измерительными тест-системами;

— аналиты и вид биологического материала (при необходимости);

— условия применения, транспортирования и хранения;

— ссылку на методики (методы) измерений, по которым проводятся данные измерения;

— руководство оператора ридера;

— руководство пользователя программного обеспечения ридера;

— сведения о наличии и характеристиках ПО в соответствии с

ГОСТ Р 8.654 , сведения об уровне защиты ПО в соответствии с

рекомендациями  [6].

5.3.5 Методики (методы) измерений должны соответствовать требованиям

ГОСТ Р 8.563  и

ГОСТ 8.010  и быть аттестованы согласно

ГОСТ Р 8.563  и

[7] . Документация на методику (метод) измерений должна содержать:     

— наименование методики (метода) измерений;

— назначение и область применения методики (метода) измерений;

— условия выполнения измерений;

— требования к квалификации операторов;

— требования к обеспечению безопасности выполняемых процедур, экологической безопасности и др.;

— требования к показателям точности измерений;

— применяемые средства измерений;

— требования к вспомогательным устройствам, материалам и реактивам (при необходимости);

— описание подготовки измерительной биохимической тест-системы для анализа (при необходимости);

— пошаговое описание процедуры проведения измерений;

— операции обработки результатов измерений (при необходимости);

— процедуры и периодичность контроля точности получаемых результатов анализа.

      6 Характеристики и технические требования к индикаторным биохимическим тест-системам

Индикаторные биохимические тест-системы не являются средствами измерений, поэтому к ним не предъявляются обязательные метрологические требования.

      6.1 Характеристики индикаторных биохимических тест-систем

6.1.1 Характеристики индикаторных биологических тест-систем могут быть подтверждены в добровольном порядке.

Характеристиками индикаторных биологических тест-систем являются:

— порог чувствительности;

— время срабатывания;

— пороговая концентрация.

6.1.2 Результатом анализа, проводимого с помощью индикаторных тест-систем, должно быть однозначное определение присутствия или отсутствия компонента в пробе и (или) в биологической жидкости или ткани.

6.1.3 Порог чувствительности не должен превышать пороговую концентрацию.

6.1.4 Фактическое время срабатывания должно соответствовать времени срабатывания, указанному в сопроводительной документации к индикаторным тест-системам

      6.2 Технические требования к индикаторным биохимическим тест-системам

К техническим требованиям к индикаторным тест-системам относятся:

— назначение, определяющее основные функции индикаторных тест-систем;

— указание анализируемой величины;

— указание вида биологического материала, используемого для анализа;

— срок годности;

— габаритные размеры;

— количество индикаторов;

— сведения об утилизации индикаторной тест-системы и ее составных частей;

— условия применения, транспортирования и хранения.

      6.3 Требования к документации на индикаторные биохимические тест-системы

6.3.1 Индикаторные биохимические тест-системы должны сопровождаться документацией, соответствующей требованиям

ГОСТ 2.601 . Документация должна полно и однозначно описывать назначение и технические характеристики индикаторных тест-систем. При проверке документации в обязательном порядке должна происходить проверка соответствия сопроводительной документации требованиям 6.3.2-6.3.4.

6.3.2 Минимальный набор документов, сопровождающих индикаторные биохимические тест-системы, рекомендуется представлять в следующем составе:

— паспорт;

— инструкция по применению.

6.3.3 В паспорте отображают технические требования и следующую информацию:

— наименование индикаторных биохимических тест-систем;

— назначение;

— сведения об изготовителе;

— указание анализируемой величины;

— указание вида биологического материала, используемого для анализа;

— дату изготовления;

— номер серии, номер и дату выдачи паспорта;

— гарантии изготовителя;

— срок годности;

— габаритные размеры;

— количество индикаторов;

— требования к безопасности индикаторных тест-систем;

— сведения о сертификации изделия;

— сведения об утилизации изделия;

— пороговую концентрацию;

— порог чувствительности;

— время срабатывания;

— условия применения, транспортирования и хранения.

6.3.4 Инструкция по применению индикаторных биохимических тест-систем должна содержать следующие разделы:

— назначение;

— меры предосторожности при работе с индикаторными тест-системами;

— оборудование и материалы, необходимые при работе с индикаторной тест-системой;

— анализируемые растворы или биологические жидкости и ткани (при необходимости);

— подготовка индикаторных тест-систем для анализа (при необходимости);

— описание процедуры проведения анализа;

— условия применения, транспортирования и хранения.

      7 Требования безопасности

7.1 Биохимические тест-системы должны быть безопасными для пользователей, а также для окружающей среды.

7.2 В эксплуатационной документации и технических условиях на биохимические тест-системы, при необходимости, должны быть указаны возможные виды опасности, а также требования и средства обеспечения безопасности при их использовании.

7.3 При работе с биохимическими тест-системами следует соблюдать требования, установленные

правилами по охране труда  [3].

      8 Требования к охране окружающей среды

8.1 При работе с биохимическими тест-системами следует соблюдать требования, установленные Федеральным законом

[4] .

8.2 Биохимические тест-системы не должны быть источниками опасных излучений и выделений вредных веществ, загрязняющих окружающую среду выше норм, установленных в

ГОСТ 12.1.005 .

8.3 В технических условиях и эксплуатационной документации на тест-системы должны быть установлены требования к утилизации изделия.

 Библиография

Определение родовой, видовой и таловой принадлежности микроорганизмов на основании изучения морфологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных и антигенных свойств — наиболее ответственная часть микробиологического исследования.

Большое количество патогенов, принимающих участие в возникновении инфекционного процесса, обусловливает применение различных тестов по определению ферментативных свойств путем постановки большого количества биохимических реакций, что позволяет в комплексе с другими данными определить вид микроорганизма. Этот наиболее трудоемкий процесс выполняется в несколько этапов, требует большого количества дифференциально-диагностических сред, реактивов, посуды, что значительно удорожает стоимость анализа и удлиняет сроки его проведения. Результаты удается получить через 4…7 сут. Поэтому для идентификации микроорганизмов наиболее перспективны микрообъемные коммерческие тест-системы (МТС). Они избавляют практических бактериологов от трудоемких и дорогостоящих процедур и позволяют получать стандартные, сопоставимые, воспроизводимые данные, экономят реактивы, ускоряют выдачу результата анализа.

Коммерческие тест-системы для биохимической идентификации микроорганизмов различных групп представляют собой готовые к использованию полистироловые планшеты и панели с сухими дифференцирующими средами или субстратами, которые выпускаются разными производителями.

Коммерческие тест-системы на основе полистироловых планшетов. В Российской Федерации наибольшее распространение получили следующие тест-системы.

1. Микротест-системы (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала) для идентификации микробов. Они представляют собой контейнер из прозрачного полистирола, состоящий из 12 одинаковых ячеек, которые содержат сухие питательные среды с различными углеводами, многоатомными спиртами, аминокислотами, солями неорганических кислот и индикатором pH, стабилизированные поливиниловым спиртом. Перечень выпускаемых МТС для идентификации микроорганизмов, имеющих ветеринарное назначение, включает в себя МТС-М-12Е (биохимическая идентификация энтеробактерий), МТС-5У (определение ферментативной активности энтеробактерий), МТС-С (биохимическая идентификация стафилококков), МТС-Стреп (биохимическая идентификация стрептококков), МТС-Л (биохимическая идентификация листерий), МТС-Сальм (биохимическая идентификация сальмонелл).

2. МТС («Плива-Лахема», Чехия) для биохимической идентификации энтеробактерий (ЭНТЕРО-тест 16; ЭНТЕРО-тест 24; ЭНТЕРО-скрин; ЭНТЕРО-Рапид 24), для энтерококков (ЭН-коккус-тест), стафилококков (СТАФИ-тест 16), стрептококков (СТРЕПТО-тест 16), анаэробов, выделенных из пищевых продуктов и кишечника (АНАЭРО-тест 23), бактериальной бета-лактамазной активности (бета-ЛАКТАМ-тест).

3. Одноразовые диагностические пластины (НПО «Диагностические системы», НИИЭМ, г. Нижний Новгород) ПБДБ (для идентификации энтеробактерий) и ПБДС (для идентификации стафилококков).

4. Системы на основе стандартных 96-луночных микротитровальных планшетов для идентификации энтеробактерий (ММТ-Е1 и ММТ-Е2) (Ставропольская государственная медицинская академия).

5. Наборы для ускоренной (в течение 5 ч) идентификации энтеробактерий РапидЭнтеро 200 и РапидЭнтеро 750 (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург).

Помимо вышеперечисленных используют и зарубежные диагностические системы для идентификации различных микроорганизмов в течение 3…48 ч: API, ID (Bio Merieux, Франция), BBL Crystal (Becton Dikinson), «MicroScan» (Dade, США), MicroTax (Sy-Lab, Австрия).

Диагностические полоски и диски для биохимической идентификации микроорганизмов. Системы индикаторные бумажные (СИБ) представляют собой полоски или диски из хроматографической бумаги, пропитанные соответствующим субстратом и индикатором и покрытые для стабилизации водным раствором поливинилового спирта.

Реакцию ставят, как правило, пробирочным методом. В пробирку помещают 0,3 мл физиологического раствора или мясопептонного бульона, затем туда вносят петлей колонию изучаемого микроба и соответствующий диск. Учет реакции через 4…5 ч по изменению цвета бумажного диска. Срок годности СИБ составляет 1 год. СИБ для идентификации энтеробактерий производит НПО «Диагностические системы» (НИИЭМ, г. Нижний Новгород), коммерческие наборы СИБ для ускоренного определения колититра воды — ФГУП НПО «Питательные среды» (г. Махачкала). СИБ по сравнению с МТС гораздо дешевле, зато работа с ними требует больше труда и времени.

Могут быть использованы как дополнительные к планшетным, так и самостоятельно в качестве идентификационных диагностические полоски («Плива-Лахема» производит семь типов). Диагностические полоски представляют собой пластмассовые полоски, на одном конце которых наклеена полоска индикации из фильтровальной бумаги, содержащей субстрат для выявления бактериального фермента или метаболита. В зависимости от типа полосок бактериальную культуру или наносят непосредственно на зону индикации полоски, или ее опускают в пробирку с исследуемой бактериальной суспензией и выращивают в течение определенного времени. Перечень выпускаемых диагностических полосок включает в себя: 1) ОКСИ-тест (для выявления бактериальной цитохромоксидазы); 2) ОНР-тест (для обнаружения β-галактозидазы); 3) ГИППУРАТ-тест (для обнаружения способности бактерий гидролизовать гиппурат натрия, а также для предварительной идентификации стрептококков группы B и Campylobacter jejuni); 4) ПИРА-тест (для быстрого выявления активности фермента пирролидонилариламидазы), а также для дифференциации энтерококков (тест положительный) от стрептококков (за исключением S. pyogenes); 5) ВП-тест (для постановки реакции Фогэс—Проскауэра за 2…4 ч).

Помимо диагностических полосок можно использовать также диагностические диски («Плива-Лахема»), позволяющие проводить простую селективную изоляцию и дифференциацию бактерий прямо на питательной среде. Диски из фильтровальной бумаги содержат определенные концентрации высушенных реагентов для выявления специфической бактериальной активности.

1. Диски с бацитрацином (10 ЕД). Применяют для селективной изоляции Haemophilus spp. при первичном культивировании. Тест основан на устойчивости Haemophilus spp. к высоким концентрациям бацитрацина по сравнению с сопутствующей флорой и саттелитного роста микроорганизмов этого рода в зоне диффузии экзогенных факторов роста из культуры S. aureus.

2. Диски с бацитрацином S. Предназначены для предварительной индикации β-гемолитических стрептококков группы А (S. pyogenes). Тест основан на высокой чувствительности S. pyogenes к незначительным концентрациям бацитрацина (0,04 ЕД), обеспечивающей образование зон задержки роста вокруг диска. Другие β-гемолитические стрептококки резистентны к таким дозам или образуют незначительные зоны ингибиции роста.

3. Диски с оптохином. Предназначены для рутинной первичной индикации S. pneumoniae и дифференциации их от других зеленящих стрептококков. Принцип теста основан на избирательной чувствительности пневмококков к оптохину и резистентности к нему других зеленящих стрептококков.

Общие правила работы с МТС. Методика проведения микробиологических исследований с использованием МТС должна полностью соответствовать прилагаемой инструкции. Общая схема работы с тест-системами состоит из следующих этапов.

1. Выделение культуры. Для работы с МТС используют только чистые культуры. При их выделении особое внимание следует уделять качеству питательных сред. От этого зависит видовой состав изолированных микроорганизмов, их количество в исследуемом материале и успех идентификации. По результатам первичного посева и микроскопии проводят дифференциацию культур на грамположительные и грамотрицательные кокки и палочки.

2. Приготовление бактериальной суспензии. Суспензию готовят в рекомендованной суспензионной среде из чистой 18…24-часовой культуры определенной степени мутности согласно инструкции. Использование слишком густой или жидкой суспензии может привести к ложным результатам. Параллельно делают контрольный высев взвеси культуры на кровяной агар для проверки ее чистоты, ростовых свойств и (или) для постановки дополнительных тестов.

3. Инокуляция. Суспензию тщательно встряхивают; необходимый объем вносят в каждую лунку соответствующего ряда. После этого в определенные лунки для создания анаэробных условий добавляют по 2 капли стерильного вазелинового или парафинового масла.

4. Инкубация. Планшеты в полиэтиленовых пакетах или закрытые крышками инкубируют при 30…37 °С в течение 4…48 ч.

5. Оценка результатов. По окончании выращивания проверяют чистоту культуры по контрольному посеву. При отсутствии роста увеличивают время инкубации. Затем добавляют в определенные лунки необходимые реактивы, позволяющие визуализировать или усилить цветные реакции. Учет проводят визуально с помощью специальных таблиц, цветовых шкал и (или) цветных реакций контрольных штаммов и заносят их в бланки.

6. Идентификация. Проводят с помощью таблиц биохимической активности, индексов профилей, книг-кодов или компьютерных программ.

При окончательной идентификации учитывают дополнительную информацию (микроскопия, характер колоний, наличие гемолиза, пигментообразование, подвижность и т. д.).

При работе с тест-системами следует придерживаться следующих рекомендаций.

1. Строго соблюдать правила работы с инфицированным материалом.

2. После употребления МТС необходимо обезвреживать автоклавированием при (120+2) °С в течение 1 ч.

3. Строго соблюдать условия и сроки хранения в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к тест-системам.

4. Если культуру не удается идентифицировать, следует проверить ее чистоту и повторить исследование.

5. При отсутствии роста на контрольной чашке необходимо увеличить время инкубации.

Биохимические тесты в планшетном формате широко применяются для видовой идентификации во многих лабораториях, где не доступны методы МАЛДИ-ТОФ и автоматические биохимические анализаторы. Наборы тестов относительно не дороги, не требуют специального оборудования, но при этом обеспечивают достаточно высокий уровень видовой идентификации бактерий.

Такие биохимические тест-наборы выпускаются различными фирмами для различных групп бактерий, но принцип постановки и учета результатов в большинстве случаев очень похож. В данном видео подробно рассказывается, как пользоваться планшетными тест-системами, на примере набора NefermTest 24 фирмы Erba Lachema, который служит для идентификации неферментирующих грам-отрицательных бактерий.

Видео предназначено для практикующих микробиологов и лаборантов баклабораторий. Посмотрев это видео, вы сможете хорошо подготовиться и затем с уверенностью работать с настоящими биохимическими тест-системами.

Продолжительность видео-урока 28 минут. После оплаты вы получите PDF-файл со ссылкой на неограниченный просмотр видео.

×

Дифференциация и идентификация возбудителей (опреде­ление родовой, видовой и типовой принадлежности микроор­ганизмов) – наиболее ответственный этап микробиологичес­кого исследования. Он осуществляется на основании изучения целого комплекса свойств микроорганизмов: морфологичес­ких, тинкториальных, культуральных, ферментативных и анти­генных.

Широкий спектр микроорганизмов, играющих роль в воз­никновении инфекционного процесса, требует изучения фер­ментативной активности выделенных микроорганизмов путем постановки большого количества различных биохимических реакций, позволяющих по сочетанию полученных результатов в комплексе с другими данными определить вид микроорга­низма. Этот раздел работы наиболее трудоемкий, проводится в несколько этапов, требует приготовления большого количе­ства питательных сред, дефицитных реактивов, посуды и т.д. При переходе от классических методов к современным ориен­тир следует смещать от многоступенчатых исследований к уни­фицированной процедуре с приданием большего значения стандартизации, ускорению, воспроизводимости, миниатюри­зации и автоматизации.

Коммерческие микротест-системы или слайды для биохими­ческой идентификации микроорганизмов различных групп – это готовые к использованию полистироловые панели (или планшеты) с сухими дифференциальными средами. В нашей стране такие тест-системы производят в Ставрополе (ФГУП «Аллерген»), Махачкале (НПО «Питательные среды»), Ниж­нем Новгороде (НПО «Диагностические системы»), Санкт-Пе­тербурге (НИИЭМ им.Л.Пастера). Достаточно известны в на­шей стране диагностические панели API (фирма «bioMerieux», Франция), BBL Crystal (фирма «Becton Dickinson», США), тест-панели «Bio-Rad» (Франция), MICRO-LA-TEST (фирма «PLIVA-Lachema», Чехия) и др. для идентификации различных микроорганизмов.

Для работы широкого круга микробиологических лаборато­рий с практической точки зрения наилучшим образом себя зарекомендовали тест-системы мультимикротестов для биохи­мической идентификации энтеробактерий (ММТ El и ММТ Е2) и коринебактерий (ММТ D) производства ФГУП «Ал­лерген», а также диагностикумы MICRO-LA-TEST фирмы «PLIVA-Lachema» для идентификации широкого спектра воз­будителей, ответственных за возникновение гнойно-воспали­тельных и инфекционных заболеваний (энтеробактерий и виб­рионы, стафилококки, стрептококки, энтерококки, нефермен-тирующие грамотрицательные бактерии, анаэробы, нейссерии). Данные микротест-системы представляют собой цельнолитую или стрипованную (разделенную на 8-луночные стрипы) пластмас­совую пластинку-планшет размером 8,5 х 12,5 см с 96 лунками. В лунках содержатся высушенные питательные среды и суб­страты для биохимических реакций, которые растворяются по­сле добавления суспензии микроорганизмов (инокулята испы­туемых штаммов). Дифференциальные биохимические тесты-ре­акции в тест-системах подобраны таким образом, чтобы про­вести идентификацию наибольшего количества таксонов за один этап. В течение времени инкубации во время размноже ния микроорганизмов происходят биохимические реакции, ре­зультаты которых можно зарегистрировать либо визуально, либо при помощи приборов-фотометров по изменению цвета индика­тора (рис. 17.1). В дальнейшем техника работы с тест-системами будет рассмотрена на примере указанных тест-систем.

Рис. 17.1. Микротест-система для идентификации микроорганизмов.

17.1.1. Общие правила работы с микротест-системами для идентификации микроорганизмов

Методика проведения микробиологических исследований с использованием микротест-систем должна полностью соответ­ствовать инструкциям, прилагаемым к каждому виду тест-сис­тем. Качество тест-систем контролируют с помощью контроль­ных референтных бактериальных культур, перечень которых приводится в инструкциях к тест-системам. Тем не менее суще­ствует общий унифицированный подход к идентификации мик­роорганизмов при помощи микротест-систем, техника работы с которыми достаточно проста и состоит из следующих этапов.

1. Выделение культуры.

При идентификации микроорганизмов необходимо работать только с чистой культурой, поскольку присутствие посторон­них микроорганизмов может исказить результаты исследова­ния и послужить поводом для ошибочного заключения. Выде­ляют чистые культуры общепринятыми в микробиологии ме­тодами. Особое внимание следует уделять качеству питатель­ных сред, используемых для выделения возбудителей инфек­ционного процесса. От этого зависят и количество идентифи­цируемых видов, и успех идентификации.

По результатам первичного посева и данных микроскопии проводится дифференциация культур на грамположительные и грамотрицательные кокки и палочки.

1. Приготовление бактериальной суспензии:

• бактериальную суспензию готовят в суспензионной среде (прилагается к тест-системе или указывается в инструк­ции) из чистой 18–24-часовой культуры бактерий опре­деленной степени мутности по стандарту МсFarland (для отечественных тест-систем – стандарт ОСО). Тщательно гомогенизируют суспензию. Слишком густая или жидкая суспензия может привести к ложным результатам;
• параллельно делают контрольный высев суспензии куль­туры на кровяной агар для проверки чистоты культуры, ее ростовых свойств и(или) для постановки дополнитель­ных тестов;
• эту же суспензию используют для постановки дополни­тельных тестов с диагностическими полосками.¹

1. Инокуляция:

• суспензию бактерий тщательно встряхивают и в необхо­димом объеме (указывается в инструкции) инокулируют в ячейки в соответствии с инструкцией к тест-системе;
• после инокуляции в определенные лунки для создания анаэробных условий добавляют стерильное вазелиновое (или парафиновое) масло.

1. Инкубация:

• инокулированные тест-системы в полиэтиленовых паке­тах или прикрытые крышками инкубируют в термостате при температуре 30–37 °С в течение 4–48 ч (в зависи­мости от вида тест-системы).

1. Оценка результатов:

• по окончании инкубации проверяют чистоту культуры по контрольному посеву;
• при отсутствии роста в лунках следует увеличить время (продолжительность) инкубации;
• добавляют в определенные лунки необходимые реактивы;
• учитывают результаты биохимических реакций визуально с помощью таблиц «Интерпретация реакций» и(или) цветовых шкал и заносят их в бланки.

1. Идентификация:

– идентификацию проводят с помощью таблиц биохими­ческой активности, профильных индексов, диагностичес­ких регистров (книг кодов) или компьютерной про­граммы.

При окончательной идентификации следует учитывать всю дополнительную информацию о культуре микроорганизма (микроскопию, характер роста колоний, наличие пигмента, подвижность, источник выделения и т. д.). При идентифика­ции с помощью таблиц биохимической активности проводят поиск вида культуры с аналогичными результатами реакций. Такой метод пригоден и достаточно достоверен для групп с малым количеством тестов и таксонов. Идентификацию с ис­пользованием профильных индексов применяют для определе­ния вида бактерий путем вычисления их цифрового профиля. Это позволяет проводить интерпретацию результатов по стан­дартной процедуре. В профильные индексы включено боль­шинство возможных комбинаций тестов, с их использованием возможна идентификация типичных культур, включенных в «Идентификационную таблицу» тест-системы.

Методика расчета профиля культуры. Результаты срабатыва­ния биохимических реакций переводят в цифровой код – про­филь. Для этого всю последовательность тестов в тест-системе (от первого до последнего) разбивают на триады. В каждой из триад положительно сработавшим тестам присваивают число­вые значения: первый тест в триаде –»1″, второй тест в триаде – «2», третий тест в триаде – «4». Всем отрицательным результатам присваивается «0».

Суммируют числовые значения в триадах. Полученный чис­ловой код соответствует профилю исследуемого микроорганизма.

Например:

В книге кодов полученный профиль (код) 361 соответствует культуре вида Klebsiella pneumoniae/pneumoniae.

На практике аналогично рассчитанный профиль использу­ется при идентификации с помощью книг кодов, при этом для каждого таксона определяются два следующих показателя:

▲ процент идентификации (%id) – показывает, насколько по­лученный профиль соответствует идентифицируемому мик­робу по сравнению с другими таксонами, включенными в банк данных (%id – критерий отличия микроба от других таксонов);

▲ Т-индеке (Tin) – показывает соответствие профиля полу­ченной культуры большинству типичных реакций для иден­тифицированного таксона. Значение этого показателя ва­рьирует от 0 до 1 и обратно пропорционально количеству атипичных для таксона тестов.

Книги кодов позволяют получать достоверную идентифика­цию и в случае выявления 1–2 атипичных для исследуемого таксона результатов (тестов).

Идентификация микроорганизмов семейства Enterobacteriaсеае. Идентификацию микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae следует проводить с использованием микротест-систем: ММТ El и ММТ Е2 (ФГУП «Аллерген»), ENTEROtest 24, ENTEROtest 16, ENTERO-Rapid 24, ENTERO-Screen, а также диагностических полосок COLItest и SALMtest («PLIVA-La­chema») и других диагностикумов.

Применение систем мультимикротестов ММТ El и ММТ Е2. Системы мультимикротестов ММТ El и ММТ Е2 предназна­чены для определения биохимической активности и последую­щей идентификации наиболее распространенных представите­лей семейства энтеробактерий и дифференциации их от неко­торых бактерий из семейства вибрионов в течение 18–24 ч. ММТ El позволяет определить 12 ключевых тестов: образова­ние сероводорода, индола, наличие лизиндекарбоксилазы, ор-нитиндекарбоксилазы, уреазы, фенилаланиндезаминазы, ути­лизация цитрата натрия, малоната натрия, маннитола, сахаро­зы, лактозы и сорбита. ММТ Е2 позволяет определить 12 дополнительных биохимических свойств, которые в сочетании с 12 ключевыми тестами, определяемыми в ММТ El, служат для видовой идентификации энтеробактерий: наличие арги-ниндегидролазы, бета-галактозидазы, нитратредуктазы, утили­зация инозитола, дульцита, арабинозы, рамнозы, мальтозы, адонита, раффинозы, салицина, глюкозы.

Для идентификации используют чистую культуру со среды Эндо или кровяного агара. Ставят тест на ферментацию глю­козы (O/F-тест) на среде Хью–Лейфсона для установления принадлежности выделенной культуры к группе ферментирующих микроорганизмов и тест на оксидазу для дифференциа­ции энтеробактерий от вибрионов и других оксидазоположи-тельных культур.

Применение микротест-системы ENTEROtest 24. ENTERO­test 24 предназначен для определения биохимической актив­ности и идентификации наиболее важных для патологии чело­века микроорганизмов семейства энтеробактерий и дифферен­циации их от некоторых представителей семейства вибрионов в течение 18–24 ч. ENTEROtest 24 позволяет провести для каждой культуры 24 биохимических теста, размещенных в трех­рядных стрипах (3×8 лунок): индол, сероводород, лизин, орнитин, уреаза, аргинин, цитрат Симмонса, малонат натрия, фенилаланин, бета-галактозидаза (ONPG), инозит, адонит, цел-лобиоза, сахароза, трегалоза, маннитол, ацетоин (Фогес– Про-скауэр), эскулин, рамноза, сорбитол, мелибиоза, раффиноза, дульцит, глюкоза.

Для идентификации используют чистую культуру со среды Эндо или кровяного агара. Ставят тест на ферментацию глю­козы (O/F-тест) на среде Хью–Лейфсона для установления принадлежности выделенной культуры к группе ферментиру­ющих микроорганизмов и тест на оксидазу для дифференциа­ции энтеробактерий от вибрионов и других оксидазоположи-тельных культур.

Применение микротест-системы ENTEROtest 16. ENTEROtest 16 предназначен для определения биохимической активности и последующей идентификации наиболее важных для патоло­гии человека микроорганизмов семейства энтеробактерий в течение 18–24 ч. Система представляет собой двухрядный стрип (2×8 лунок) с высушенными питательными средами и реагентами для определения 16 ключевых тестов: сероводород, лизин, индол, орнитин, уреаза, фенилаланин, эскулин, цитрат Симмонса, малонат, инозит, адонит, целлобиоза, сахароза, сор­битол, трегалоза и маннитол. Идентификация должна быть дополнена тестами на бумажных полосках для определения цитохромоксидазы, бета-галактозидазы и продукции ацетоина (VP-тест).

Для идентификации используют чистую культуру со среды Эндо, кровяного агара или агара MacConkey. Следует также поставить тест на ферментацию глюкозы для установления факта принадлежности выделенной культуры к группе фермен­тирующих микроорганизмов. Ставят тест на выявление цито­хромоксидазы с помощью полосок OXI-тест для выявления оксидазоположительных микроорганизмов из родов Aeromonas, Plesiomonas и Vibrio. Биохимическую идентификацию сальмо­нелл, шигелл и кишечной палочки, выделенной у больных с гастроэнтеритами, подтверждают серологически.

Ускоренные методы идентификации некоторых энтеробактерий

Применение микротест-системы ENTERO-Screen. ENTERO-Screen предназначен для ускоренной (в течение 4 ч) иденти­фикации энтеробактерий, наиболее часто встречающихся при мочевых и других инфекциях, а также для выявления сальмо­нелл и кишечной палочки в санитарно-эпидемиологических исследованиях. Система представляет собой стрип (8 лунок) с субстратами для определения 8 ключевых тестов: глюкоза в анаэробных условиях, ацетоин, фенилаланин, индол, сахароза, уреаза, лизин, орнитин. Идентификация должна быть допол­нена тестами на бумажных полосках: OXI-тест, PYR-тест на выявление пиразы, SALMtest для обнаружения присутствия сальмонелл и COLItest для обнаружения присутствия E.coli.

Для идентификации используют чистую культуру со среды Эндо, агара MacConkey, кровяного агара, ставят тест на цито-хромоксидазу (OXI-тест).

Следует обращать внимание на то, что некоторые культуры сальмонелл могут показывать отрицательную или замедленную реакцию в тестах на лизин или орнитин. В случае подозрения на принадлежность к роду сальмонелл выполняют расширен­ную идентификацию при помощи набора ENTEROtest 16 или ENTEROtest 24. Аналогично поступают с культурами, которые не удалось идентифицировать при помощи ENTERO-Screen. При окончательной идентификации учитывают всю дополни­тельную информацию (характер роста колоний, микроскопию, утилизацию лактозы, подвижность, источник выделения и т.д.). При отрицательном тесте ферментации глюкозы в анаэ­робных условиях можно предположить отнесение данной куль­туры к неферментирующим бактериям.

Применение микротест-системы ENTERO-Rapid 24. Набор ENTERO-Rapid 24 предназначен для быстрой идентификации наиболее важных для патологии человека энтеробактерий за 4 ч при помощи 24 тестов, размещенных в трехрядных стрипах (3×8 лунок): индол, лизин, орнитин, уреаза, сахароза, сорбитол, трегалоза, глюкоза, пираза, эскулин, целлобиоза, мелибиоза, салицин, манноза, мальтоза, раффиноза, ацетоин (Фогес– Проскауэр), фенилаланин, малонат натрия, бета-галактозидаза (ONPG), бета-глюкуронидаза, альфа-галактозидаза, бета-кси-лозидаза, ^ацетил-бета-О-глюкозаминидаза.

Использование диагностических полосок для ускоренной ори­ентировочной идентификации сальмонелл и кишечной палочки (SALMtest, COLItest). Диагностическая полоска SALMtest пред­назначена для обнаружения типичного для рода сальмонелл признака – активности фермента С8-эстеразы. Высокая чувст­вительность теста по отношению к роду сальмонелл вместе с несложной методикой выполнения и быстротой получения результатов реакции позволяют применить SALMtest в скринин-говых исследованиях для обнаружения сальмонелл не только в клинике, но и в пищевой промышленности и т.п.

Принцип действия SALMtest фермент С8-эстераза гидро-лизирует 4-метилумбеллиферил каприлат, содержащийся в тес­товой зоне полоски. Освобожденный 4-метилумбеллиферрон под воздействием ультрафиолетовых лучей (применяется УФ-лампа с длиной волны испускаемого света около 360 нм) флюоресцирует синим светом, что регистрируется как положи­тельная реакция.

Методика постановки SALMtest:

∆ для тестирования используют 24-часовую культуру, подо­зрительную на сальмонеллы, со среды Эндо, агара с брил­лиантовым зеленым, агара МасСоnкеу, агара с эозин-метиленовым синим1;

∆ добавляют на тестовую зону полоски приблизительно 10 мкл специального реактива для SALMtest;

∆ при помощи микробиологической петли распределяют про­веряемую культуру по зоне; в случае чистой культуры (или же достаточно хорошо изолированных друг от друга коло­ний на агаровой среде) можно снимать культуру с поверх­ности агара, приложив к ней непосредственно полоску;

∆ полоску инкубируют 10–15 мин при комнатной температуре;

∆ по истечении упомянутого времени учитывают реакцию под УФ-лампой; положительная реакция проявляется возникно­вением синей флюоресценции в зоне полоски;

∆ штаммы с положительной реакцией в последующем иден­тифицируют, например, при помощи набора ENTERO-Screen.

Примечания к методике постановки SALMtest:

∆ при проведении теста всегда используют отрицательный контроль: реактив добавляют на зону полоски и инкубируют без нанесения бактериальной культуры;

∆ считывание реакции под УФ-лампой выполняют в темноте, лучше всего в специальной установке, предназначенной для оценки флюоресценции (например, шкаф Гансена);

∆ несмотря на то, что SALMtest дает ложноположительные реакции у некоторых микроорганизмов, он дает положи­тельный результат у 100 % сальмонелл.

Диагностические полоски СОLItest предназначены для бы­строй идентификации кишечных палочек и дифференциации их от других грамотрицательных оксидазоотрицательных бактерий, выделенных из клинического материала, пищевых про­дуктов, воды и т.д. Идентификация основана на определении глюкуронидазной активности и образования индола. Результа­ты анализов учитываются через 4 ч инкубации в термостате.

Принцип метода: фермент бета-глюкуронидаза расщепляет 4-метилумбеллиферил-D-глюкуронид с высвобождением при этом 4-метилумбеллиферона, который в ультрафиолетовых лу­чах флюоресцирует голубым светом. Продукция индола из L-триптофана определяется по появлению красного окраши­вания после добавления специфического реагента на индол (р-диметиламинобензальдегид).

Методика постановки СОLItest:

∆ для проведения исследования используют культуру коли-формных бактерий и(или) грамотрицательных оксидазоот-рицательных палочек;

∆ готовят 0,5–1,0 мл суспензии тестируемого микроорганизма в стерильном физиологическом растворе, мутность суспен­зии должна соответствовать номеру 3 по шкале McFarland;

∆ помещают полоску СОLItest в пробирку с суспензией (бу­мажная зона полоски должна быть полностью погружена в суспензию);

∆ инкубируют пробирки с полосками при температуре 37°С в течение 4 ч (предварительный результат теста на глюку-ронидазную активность может быть получен через 1 ч).

Учет результатов:

∆ сначала учитывают результаты глюкуронидазной реакции в темном месте с использованием УФ-лампы (длина волны 360 нм);

∆ затем в пробирку с суспензией добавляют 4–5 капель реак­тива на индол.

Оценка результатов:

у типичных штаммов кишечной палочки – глюкуронидаза (+), индол (+). У некоторых штаммов кишечной палочки мо­жет быть глюкуронидаза (–), индол (+) или глюкуронидаза (+), индол (–). Такие штаммы подлежат дальнейшей идентифика­ции при помощи микротест-систем1.

Идентификация неферментирующих микроорганизмов при по­мощи микротест-системы при помощи микротест-системы NEFERMtest 24. NEFERMtest 24 предназначен для биохимической идентификации грамотрицатель­ных неферментирующих бактерий, прежде всего из клиничес­кого материала. При помощи этой тест-системы можно также выполнить идентификацию встречающихся в клинической практике представителей ферментирующих оксидазоположи-тельных грамотрицательных палочек. Тест-система представля­ет собой трехрядный стрип (3×8 лунок) с субстратами для проведения 24 тестов: индол, аргинин, уреаза, лизин, глюкоза, фруктоза, инозитол, сахароза, фосфатаза, бета-галактозидаза, бета-глюкозидаза, М-ацетил-бета-Б-глюкозаминидаза, манни-тол, ксилоза, целлобиоза, галактоза, нитраты, нитриты, эскулин, гамма-глутамилтрансфераза, лактоза, мальтоза, трегалоза и цитрат Симмонса.

Чистую культуру следует выделять на кровяном агаре (агар с кровью барана). С чистой 24-часовой культурой ставят тест на выявление цитохромоксидазы (полоска OXI-тест). При окон­чательной идентификации следует учитывать всю дополнитель­ную информацию (источник выделения бактерий, характер роста колоний, микроскопию и другие характеристики: нали­чие пигмента или флюоресценции, рост при температуре 42 °С, гемолиз, рост на агаре MacConkey, наличие каталазной ак­тивности, подвижности, гидролиза желатина, результаты O/F-теста).

Идентификация стафилококков при помощи микротест-систе­мы STAPHYtest 16. STAPHYtest 16 предназначен для быстрого и надежного отличения стафилококков от других грамположительных кокков (Micrococcus, Stomatococcus и Aerococcus), про­стой и быстрой идентификации клинически важных видов стафилококков. Тест-система представляет собой двухрядный вертикальный стрип (2×8 лунок) с субстратами для проведе­ния 16 тестов: уреаза, аргинин, орнитин, бета-галактозидаза, бета-глюкуронидаза, нитраты, фосфатаза, пирролидониларила-мидаза, эскулин, сахароза, трегалоза, маннитол, ксилоза, маль­тоза, манноза, глюкоза/новобиоцин. Дополнительно следует использовать бумажные полоски для определения ацетоина (VP-тест) и определения цитохромоксидазы (OXI-тест).

Выделяют чистую культуру на кровяном агаре в соответст­вии с инструкцией к тест-системе.

Идентификация стрептококков при помощи микротест-систе­мы STREPTOtest 16. STREPTOtest 16 предназначен для опре­деления биохимической активности и идентификации стреп­тококков по 16 биохимическим тестам, расположенным в двух­рядном стрипе (2×8 лунок): гиппурат, фосфатаза, лейцинами-нопептидаза, бета-глюкуронидаза, альфа-галактозидаза, эску­лин, аргинин, уреаза, маннитол, сорбитол, трегалоза, лактоза, раффиноза, инулин, мелибиоза и рибоза. Идентификацию сле­дует дополнить тестами на бумажных полосках для выявления пирролидонилариламидазы и образования ацетоина.

Чистую культуру выделяют на агаре с кровью барана. Ин­кубацию посевов производят в атмосфере с содержанием 5 % углекислого газа. Для выявления каталазной активности мик­роорганизмов ставят тест на предметном стекле с 3 % раство­ром перекиси водорода.

При окончательной идентификации следует учитывать всю дополнительную информацию о культуре (микроскопию, ха­рактер роста колоний, наличие пигментообразования, гемолиз, источник выделения и т.д.).

Идентификация энтерококков при помощи микротест-системы EN-COCCUStest. EN-COCCUStest позволяет идентифициро­вать клинически значимые виды энтерококков при помощи восьми биохимических тестов (стрип из 8 лунок): аргинин, сорбоза, арабиноза, маннитол, сорбитол, мелибиоза, раффино­за и мелецитоза. Для выявления типичного для энтерококков теста – активности пирролидонилариламидазы – следует ис­пользовать тест-полоску PYR-тест.

Для идентификации используют чистую культуру, выращен­ную на агаре с кровью барана. Ставят другие тесты для под­тверждения принадлежности изолята к роду энтерококков. При окончательной идентификации следует учитывать всю допол­нительную информацию (источник выделения, микроскопию, характер роста колоний и т.д.). Образование желтого пигмента и подвижность являются важными признаками при идентифи­кации энтерококков.

Идентификация нейссерий при помощи микротест-системы NEISSERIAtest. Тест-система NEISSERIAtest предназначена для определения биохимической активности оксидазоположи-тельных, грамотрицательных кокков и коккобацилл, позволяет идентифицировать патогенные нейссерий (N.gonorrhoeae, N.me­ningitidis) и Moraxella (Branhamella) catarrhalis и дифференциро­вать их от сапрофитирующих нейссерий. Тест-система содер­жит субстраты для определения 7 ключевых биохимических тестов (один стрип из 8 лунок): глюкоза, мальтоза, фруктоза, сахароза, гамма-глутамилтрансфераза, трибутирин, синтез по­лисахаридов. 8-я лунка стрипа содержит высушенную пита­тельную среду для постановки контроля. Дополнительно сле­дует провести тест на наличие бета-галактозидазы (при помо­щи полоски ONP-тест).

Чистую культуру следует выделять на шоколадном агаре или сывороточном агаре. Чашки с агаром перед посевом нагревают до 35–37 °С. Чашки после посева инкубируют при повышен­ном содержании углекислого газа и в атмосфере повышенной влажности воздуха при температуре 35–37°С в течение 18–24 ч. Из чистой культуры делают мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют, ставят тесты на наличие оксидазы и ката-лазы. Грамотрицательные кокки и диплококки с положитель­ной реакцией на оксидазу и каталазу следует идентифицировать с помощью NESSERIAtest (исключение составляет N.elongata, представляющая собой каталазоотрицательную па­лочку).

При окончательной идентификации следует учитывать всю дополнительную информацию (микроскопию, характер роста колоний, гемолиз, пигментацию и т.д.).

Идентификация коринебактерий при помощи микротест-сис­темы ММТ D. Тест-система предназначена для определения биохимической активности и определения токсигенности ко­ринебактерий дифтерии и дифференциации их от других ко­ринебактерий, встречающихся в клиническом материале. Тест-система содержит субстраты для определения 5 ключевых био­химических тестов: глюкоза, сахароза, крахмал, уреаза, нит­раты – и диагностические бумажные диски для определения токсигенности.

Чистую культуру выделяют на среде мартеновский агар или питательный агар с добавлением 20 % сыворотки крупного рогатого скота или нормальной лошадиной сыворотки.

Учитывают результаты планшетных тестов и теста на ток-сигенность. Идентификацию следует проводить с учетом дан­ных по характеру роста, морфологии колоний, микроскопии, наличия цистиназы (проба Пизу), источников изоляции и др.

Идентификация анаэробов при помощи микротест-системы ANAEROtest 23. ANAEROtest 23 предназначен для биохимичес­кой идентификации анаэробных бактерий, прежде всего из клинического материала и из пищевых продуктов. Тест-систе­ма представляет собой тройной стрип (3×8 лунок) с реагентами для проведения 23 тестов: индол, глюкоза, мальтоза, фруктоза, галактоза, лактоза, мелецитоза, уреаза, нитраты, сахароза, са­лицин, трегалоза, маннитол, рамноза, N-ацетил-бета-D-глюко-заминидаза, бета-глюкозидаза, эскулин, манноза, раффиноза, целлобиоза, ксилоза, арабиноза и сорбитол.

Выделяют чистую культуру с использованием сред, реко­мендованных для изоляции и культивирования анаэробных бактерий, например агар Wilkins-Chalgren. Из чистой культу­ры готовят мазок и окрашивают по Граму, учитывают морфо­логию (форму и агрегацию клеток, наличие спорообразования). Окраску по Граму в сомнительных случаях можно дополнить тестом со щелочью (3 % раствор КОН). Грамположительные палочки следует проверить на терморезистентность (выдержи­вание в течение 15 мин при температуре 80 °С). Для контроля проводят культивирование каждого штамма в аэробных усло­виях.

Особенности приготовления бактериальной суспензии и инокуляции планшета:

• • в соответствии с инструкцией к тест-системе из чистой 48-часовой культуры следует приготовить суспензию в суспензионной среде для ANAEROtest 23. Мутность суспензии должна соответствовать номеру 3 по стандарту мутности Мсrland. При гомогенизации ампулу с суспензионной средой держат в вертикальном положении и двигают петлей по ее внутренней поверхности, предупреждая попадание воздуха в суспензионную среду. Инокулирование тест-сис­темы не должно превышать 20 мин.

ANAEROtest 23 следует инкубировать с индикатором анаэ­робной атмосферы.

Идентификация. По микроскопии относят идентифицируе­мую анаэробную культуру к одной из четырех групп:

∆ грамотрицательные палочки;

∆грамположительные спорообразующие палочки;

∆ грамположительные неспорообразующие палочки;

∆ кокки.

При окончательной идентификации анаэробных бактерий следует учитывать всю дополнительную информацию (источ­ник выделения, характер роста колоний, результаты тестов на патогенность и токсигенность, а также другие характеристики).

Наиболее частые причины неудач при идентификации мик­роорганизмов с использованием коммерческих микротест-сис­тем следующие:

∆ наличие смешанной культуры;

∆использование суспензий микроорганизмов с недостаточ­ной мутностью или в недостаточном объеме;

∆ перекрестная контаминация суспензий в расположенных рядом лунках;

∆ соответствующие лунки не заполнены парафиновым мас­лом;

∆ попадание реактивов в лунки соседнего ряда; Д нарушение инструкции к тест-системе при проведении ис­следования;

∆ недостижение анаэробной атмосферы при культивировании

   анаэробных бактерий;

∆ возможно выделение штамма с нетипичными свойствами или

его данные не заложены в идентификационные таблицы.

17.1.2. Применение микротест-систем для оценки антибиотикочувствительности

Оценка антибиотикочувствительности микроорганизмов требует тщательной стандартизации всех этапов исследования, наличия качественных питательных сред и антибиотиков (это относится как к методу серийных разведений, так и к диско-диффузионному методу). Одним из удобных и достаточно эко­номичных путей преодоления описанных проблем является использование готовых мик­ротест-систем, действие кото­рых основано на принципе метода серийных микроразве­дений в варианте погранич­ных концентраций (тест по­граничных концентраций – ТПК). Их применение избав­ляет от проведения наиболее трудоемких подготовительных этапов исследования (приготовления и стандартизации пита­тельных сред с растворами антибиотиков), врач получает воз­можность сконцентрировать свое внимание на получении чис­той культуры микроорганизма и стандартизации суспензии. В Государственном научном центре по антибиотикам (ГНЦА, Москва) выпускаются тест-системы ТПКтест, которые разра­ботаны на основе стандартных 96-луночных планшетов, что позволяет проводить как визуальный учет результатов, так и автоматизированный с использованием планшетных фото­метров.

Рис. 17.2. Микротест-система ТПК-тест для определения анти­биотикочувствительности мик­роорганизмов.

ТПК-тест – это микротест-система однократного примене­ния, позволяющая определить чувствительность четырех ис­следуемых микроорганизмов одновременно к 11 или 12 анти­биотикам Или шести микроорганизмов к 8 антибиотикам. В на­стоящее время выпускаются 5 типов тест-систем с оптималь­ными наборами антибиотиков для групп микроорганизмов: энтеробактерий, грамположительных бактерий, псевдомонад, возбудителей уроинфекций, стафилококков. ТПКтест (рис. 17.2) представляет собой полистироловый планшет (8×12 лу­нок), в котором содержатся 4 или 6 аналогичных наборов высушенных растворов антибиотиков в питательной среде. Каждый антибиотик представлен двумя пограничными кон­центрациями, позволяющими дифференцировать микроорга­низмы по степени чувствительности на три категории: «чувст­вительные», «умеренно-устойчивые» и «устойчивые». Большая концентрация соответствует минимальному значению МПК (минимальная подавляющая рост микроба концентрация) для устойчивых штаммов, малая концентрация соответствует мак­симальному значению МПК для чувствительных штаммов. Пример расположения и концентрации антибиотиков в лунках планшета ТПКтест на 4 культуры и 11 антибиотиков приведен на схеме-таблице.

Пример расположения антибиотиков на планшете ТПК-тест

Вертикальные ряды имеют цифровое обозначение. Горизон­тальные ряды имеют буквенное обозначение. Антибактериаль­ные препараты: амп – ампициллин, цфс – цефотаксим, цфд – цефтазидим, цфп – цефоперазон, цфр – цефтриаксон, тоб – тобрамицин, ами – амикацин, ген – гентамицин, а/с – ампициллин/сульбактам, фрк – цефуроксим, цип – ципрофлоксацин, Кр – контроль роста. Концентрации антибактериальных препаратов выражены в мкг/мл.

В тест-системе ТПКтест на 6 культур в одной культуре отводится два вертикальных ряда: в нечетных рядах – макси­мальные концентрации препаратов, в четных – минимальные.

Методика проведения исследования унифицирована для всех типов тест-систем и предполагает поэтапное выполнение следующих операций.

• • Выделение культуры:
• выделение чистой культуры следует проводить общепри­нятыми в микробиологии методами;
• для инокулирования тест-системы следует использовать чистую 18–24-часовую культуру с плотной питательной среды или чистую бульонную культуру.
• • Приготовление бактериальной суспензии:
• из изолированной колонии готовят суспензию в дистил­лированной воде и доводят мутность до номера 0,5 стан­дарта мутности по МсFarland;
• полученную взвесь разводят в 1000 раз стерильной дис­тиллированной водой;
• полученная суспензия содержит приблизительно 105 микробных клеток в 1 мл.
• • Инокулирование тест-системы:
• суспензию бактерий тщательно встряхивают;
• инокулируют по 100 мкл суспензии в лунки горизонталь­ных рядов в тест-систему ТПК-тест на 4 культуры или вертикальных рядов в ТПКтест на 6 культур.
• • Инкубирование:
• после инокулирования накрывают планшет крышкой;
• инкубируют планшеты в течение 18–24 ч в термостате при температуре 36±1 «С.
• • Учет результатов:

– проводят визуально по наличию или отсутствию роста испытуемых микроорганизмов, который оценивается по помутнению питательной среды в лунках или фотомет­рически с применением планшетного фотометра и про­граммного обеспечения; использование автоматизиро­ванной системы позволяет получить результаты антибио-тикочувствительности большинства культур уже через 6 ч от момента выделения чистой культуры.

• • Интерпретация результатов:
• культура «чувствительна» к антибиотику при отсутствии роста в обеих лунках с большой и малой концентрациями антибиотика;
• культура «устойчива» к антибиотику при наличии роста в обеих лунках;
• культура «умеренно-устойчива» к антибиотику при нали­чии роста в лунке с меньшей концентрацией и отсутст­вии роста в лунке с большей концентрацией.